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2010年1月10日 (日)

クローニング

解析をする上でベクター作りは避けて通れない道なのですが、もちろん基本的な方法は同じとして、細部は研究室によっていろいろな流儀があり、始めは戸惑うこともあります。
インサートの確認はずっとミニプレ試薬を作ってSol I, Sol II, Sol III処理、(シークエンスするなら)PEG沈、cut checkでやってきたのですが、今の研究室ではボスがポスドクの頃に精製したTaqが大量にあり、colony PCRで確認後、ミニプレキットで精製という感じです。
基本、ラージスケールでは取ってない様子。酵母のトランスフォーメーションに使うくらいならそれで問題ないのですが。

PCRからのDNA精製もキットを使用しています。フェノール/クロロホルムはこちらでも毒劇物扱いなのであまり使いたくないようです。なので、基本酵母からのDNA、RNA抽出以外ではあまり使っていない様です。そこまでキットを使っておきながらインサートのライゲーションはT4 ligaseだったりするのは少し戸惑いました。quick ligation kitもあるのですが、T4 ligaseで普通にインサートの入ったベクターが取れたので問題なかったですが。平滑末端だとどうなんでしょう。quick ligation kitもあるので平滑の時は比較してみようかな。

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